氨基酸的分离鉴定——纸层析法

一、实验目的

ü 了解层析技术的一般原理

ü 掌握纸层析的方法和原理，学会分析未知样品的氨基酸成分

二、实验原理

Ø 层析法亦称色谱法，是利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到分离的目的

Ø 固定相：是由层析基质组成的，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用

Ø 流动相：是在层析过程中，推动固定相上待分离的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界体。柱层析中一般称为洗脱液，薄层层析时称为展层剂

Ø 分配系数：是指在一定的条件下，某一组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比例，常用K来表示，它是层析中分离纯化物质的重要依据

Ø 迁移率：是指在一定条件下，某一组分在相同的时间内，在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值，常用Rf来表示

分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件，差异越大，分离效果越理想

Ø 层析根据不同的标准可以分为多种类型：如按固定相基质的形式不同可分为纸层析、薄层层析和柱层析；按流动相的形式不同可分为液相层析、气相层析和超临界层析；按分离的原理不同可分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等

Ø 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：

在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关

v 氨基酸显色反应——茚三酮反应原理：

所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质

该反应分为两步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮结合另一分子水合茚三酮和氨缩合生成有色物质

三、实验器材

大试管及塞子，大头针，三角薄层喷瓶，毛细管，吹风机，层析滤纸（新华一号），分液漏斗

四、实验材料与试剂

扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物

氨基酸混合液：0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各组份浓度均为0.5%）

显色剂：0.1%水合茚三铜正丁醇溶液

五、实验操作

Ø 取层析滤纸（20×2cm）一条，在纸的一端距边缘3cm处用铅笔划一直线，取其中点作为原点。在大试管中加入适当的扩展剂，使扩展剂的液面处于悬挂在橡皮塞上的层析滤纸的原点到底端的中间

Ø 点样：用毛细管将氨基酸混合液点在原点上，用吹风机吹干，干后再点一次。每次在纸上扩散的直径最大不超过3mm

Ø 扩展：将点好样的层析滤纸悬挂于橡皮塞的钩子上，点样端的底边浸入扩展剂约1.5cm。保持大试管的垂直，待溶剂上升15～20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，用吹风机热风吹干

Ø 显色：用三角薄层喷瓶将0.1％茚三酮正丁醇溶液均匀地喷在风干的层析滤纸条上，用热风吹干即可显出各层析斑点

Ø 计算各种氨基酸的Rf值

六、注意事项

Ø 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套

Ø 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸

氨基酸的薄层层析（TLC）

【实验原理】

聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。

聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】

(一) 试剂

1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）

3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）

4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材

聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器， 塑料手套等。

【实验方法】

(一) 薄膜的剪裁

取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2cm）。

(二) 点样

氨基酸的点样量以5ul为宜。点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。为加快样品干燥，可用吹风机吹干，注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸。

(三) 展层

在层析缸中放一个小培养皿，培养皿中倒入适量展层剂，将点好样品的薄膜斜立于培养皿中（注意点样的一端在下），展层剂的液面需低于点样线１厘米。当溶剂前沿距上边缘１厘米处时，取出膜片，立即用笔标出溶剂前沿的位置，自然干燥或用吹风机吹干。

（四）定性鉴定

用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均匀喷雾。晾干后，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf值。

在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf值），确定氨基酸混合样中氨基酸的种

类及位置。

【注意事项】

1. 选用合适、洁净的薄膜。勿用手直接接触薄膜。

2. 点样斑点不能太大（其直径应小于2mm）。吹风机温度不宜过高，否则斑点变黄。

3. 根据一定目的、要求，选择合适的溶剂系统。

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