柱层析技术----教你怎样过柱子

柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同组分逐一分离。 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离混合物的经典层析技术。

柱层析分离净化的实验技巧和方法

1　柱层析操作方法的选择

　　目前 ,柱色谱分离的操作方式 ,主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。加压柱: 适合小于100-200g产品的纯化。大尺寸的加)柱难以制作，用起来危险性大。建议使用双链球加压。减压柱: 适合任何量的过柱，比加压柱快，需要减小流动相极性过柱(比加压柱小一倍)，不然会导致分离效果差。常压柱 : 适合大于50-100g的产品。常压柱是分离效果最好的，但是时间也最长。常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量 ,但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发 ,并且有时在柱子外面会有水汽凝结 ,以及有些易分解的化合物也难以得到 ,而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度 ,缩短样品的洗脱时间 ,是一种比较好的方法 ,与常压柱类似 ,只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气 ,双连球或者小气泵等。

2　柱子规格的选择

　　市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了 ,相应的塔板数就高 ,分离就好。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～70倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。

3　装柱

　　柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种 ,湿法省事 ,不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整。湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂"走柱子"，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂"走柱子"，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于"走柱子"时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂"走柱子"，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂 ,否则会被淋洗剂带到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。干法和湿法装柱没什么实质性差别,只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密(太密了淋洗剂流速太慢 ) ,并且一定要均匀 ,不然样品就会从一侧斜着流动。同时柱中不能有大气泡 ,大多数情况下有些小气泡没太大的影响 ,因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂 ,开裂会影响分离效果 ,甚至报废。

4　上样

　　上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。待溶剂层下降至石英砂面时 ,再加少量的低极性溶剂 ,然后再打开活塞 ,如此两三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂 ,一开始不要加压 ,等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离 (2～4 cm) ,再加压 ,这样避免了溶剂 (如二氯甲烷等 )夹带样品快速下行。很多样品在上柱前粘性较大 ,上样后在柱上又会析出 ,这一般都是比较大量的样品才会出现 ,是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,这样就必须用干法上柱了。

5　溶剂的选择

极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开。淋洗剂一般采用TLC分析（Rf=0.2~0.3）得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。

　　选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素: 溶解性，亲合性 和分离度 (Resolution)。溶剂应选择价廉、安全、环保的 ,可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高 ,乙醚很易挥发 ,二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程 ,易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少 ,要依不同需要选择。一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为 ：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate。一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果，如果没有分开的迹象，最好是换溶剂。

6　淋洗液的收集和浓缩

　　用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话 ,就不容易流出 ,这时可以采用氧化铝作固定相。柱层析后的淋洗液 ,由于使用了较多的溶剂 ,必须进行浓缩 ,如果待测物具有一定的挥发性 ,最好使用常压挥发溶剂 ,否则易导致检测结果偏低。

7 注意事项

1. 先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化2. 将柱子必须装平整、均匀3. 考虑有限柱填料的吸附量

4. 可考虑用梯度法分开并洗脱

5. 敏感化合物可以尝试氧化铝充填过柱(比如醛，容易开环的化合物)效果不错缺点是氧化铝的吸附能力稍差。需要降低流动相极性2-5倍。

6. 容易掉Boc基团的化合物，请用三乙胺碱化硅胶柱子后再过柱

7. 酸性化合物加1/1000醋酸、碱性化合物加1/1000-1/100氨水或者三乙胺或氨甲醇。

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快速柱色谱(Flash Column Chromatography)是一种快速而且（通常是）容易的分离复杂混合物的方法。柱色谱和薄层色谱的原理一样，但它可以用于制备量物质的分离。因为我们是用压缩空气将溶剂推过柱子，故称其为快速柱色谱。这不仅使分离效果更好，并且可缩短过柱时间。

制备和操作快速柱色谱：

1）确定干燥、不含溶剂的待分离混合物的重量。

2）用薄层色谱选取溶剂体系，使Rf的值处于0.2～0.3之间，但如果混合物复杂，这可能不现实。在比较复杂的情况下，可能需要借助梯度洗脱的方式，简单地说，就是在纯化洗脱的过程中不断提高溶剂的极性，该技术在后面有更加详尽的介绍。但是在薄层色谱分析中，你必需确定哪种溶剂体系将会使不同的点样处于Rf在0.2～0.3的范围之内。

3）确定用于样品上柱的方法。你可有三种选择：净试样法，溶液法或硅胶吸附法。

净试样法： 如果样品是非粘性油状物，使用净试样法最为容易。你可以用一个长的滴管过滤器将液体引入柱中，然后用预先确定的溶剂体系进行淋洗，把所有组分洗入柱子中。

溶液法： 净试样法有时可能会引起分离柱断层。因此，对于液体和固体，更为普遍的方法是将样品溶于溶剂中，然后将溶液加入分离柱。最理想的状态是，混合物中所有组分在该溶剂体系（通常是戊烷或己烷）中的Rf为0。这在多数情况下是难以实现的，所以可选用那种只移动混合物中一个化合物的溶剂，或者你可以简单地用所选择的洗脱液。记住：后面两种选择对于难度较大的分离纯化是有风险的。

硅胶吸附法： 最后一个技术是将化合物沉积（吸附）到硅胶上，这对部分液体和所有固体都是有用的。注意：硅胶是酸性的，因此这一步骤将会破坏一些对酸敏感的化合物，它们通常需要在硅胶柱上再生。首先，在一圆底烧瓶中将混合物溶解在二氯甲烷中，加入硅胶（硅胶的质量大约是化合物质量的两倍）。在旋转蒸发仪上浓缩该溶液。注意：硅胶是非常细的粉末，很容易被吸入旋转蒸发仪中。用玻璃毛塞住接头或泵的保护装置，以防止固体被吸入泵中。快速转动亦可以避免这个问题的出现。当固体基本上干燥的时候（当多数固体从容器壁上脱落，说明固体已经干燥），从旋转蒸发仪上卸下烧瓶，再用真空泵将溶剂抽尽（假设混合物中没有易挥发性物质）。注意：用玻璃毛塞住真空泵接头，否则你可能会发现硅胶（以及你的化合物）进入真空管并沉积在那里。一旦其完全干燥之后（固体中再没有气泡产生），从真空系统中取下烧瓶，用干净的刮刀从壁上刮下固体。现在，你可以简单地用粉末漏斗将这部份固体加到分离柱的顶端，然后用洗脱液淋洗（每次1.5mL）。【简单了说就是硅胶拌样时，防爆球口塞上棉花之类的东西，要不产品就会随着硅基进水泵了】

4）确定合适的硅胶和化合物的比例。对于简单的分离，通常要求两者的比例为30~50：1（重量比）；但对比较困难的分离，需要的比例高达120：1。和一些经验丰富的同事进行讨论，将对你解决这个难题大有裨益。

5) 选取合适的分离柱。你所需用的硅胶量决定了分离柱的尺寸。是使用短而粗还是长而细的分离柱，迄今为止还没有定论。我们认为短而粗的分离柱会有更好的分离效果，但是这个结论可能会被你以后的一些同事所质疑。当你首次开始实验的时候，最好的选柱方法是向实验室的同事了解：对给定的硅胶量，应选择怎样的分离柱！把结论记在笔记本上（这比测量分离柱的直径方便很多）。

6) 选取合适的收集用试管。这也是一个向有经验的同事们请教的好机会。但也有简单的方法：将硅胶体积除以4，然后选取能装下这个体积的试管就可以了。（200mL的硅胶对应于50mL的组分）

7) 一旦你选定了分离柱，你需要堵住活塞底端以避免硅胶的流失。通常，用一小团棉花或者玻璃毛加一根长棍或玻璃棒即可完成。【现在都是用磨砂底的硅胶柱，直接可以用了】

8) 在通风橱中填充分离柱。考虑到要用大量挥发性溶剂，以及干燥硅胶对于健康的危害，不允许在通风橱外进行柱的操作。检查并确定柱子是否完全垂直，倾斜的柱子不利于分离。

9）关上活塞并且加上几英寸高的洗脱液。

10) 用漏斗向分离柱中加入一些沙（干燥并且经过洗涤的）。目的是在塞堵物上铺一薄层砂（不超过1cm），这样可以避免硅胶落入收集瓶中。

11) 量取合适量的硅胶，最安全的方式是在通风橱中量取。硅胶的密度大约是0.5 g/mL，因此可以直接用锥形瓶量取（100g＝200mL）。不要让硅胶的体积超过烧瓶的1/3，因为我们还要在其中加入溶剂。

12) 在刚量取的硅胶中加入至少1.5倍体积的溶剂，将其制成浆状，用力振荡和强烈搅拌，使其充分混合，并且除去硅胶中的气体（气泡的存在将会使分离柱的效率大打折扣）。

13) 用粉末漏斗小心缓慢地将浆状物移入分离柱中，注意不要破坏下面的沙层。注意在灌浆的过程中不时地停下来并且摇动浆体，以确保硅胶混合均匀。灌浆结束后，用洗脱液反复冲洗烧瓶几次，并且将余下的溶剂硅胶混合物加入到分离柱中。

14) 用滴管和洗脱液将黏附在柱子顶部边缘上的硅胶冲洗到溶剂层中。

15) 当所有的硅胶都被洗离柱壁，打开活塞，用压缩空气给柱加压。柱内的硅胶将会压缩到原来高度的一半左右。检查以确保柱子的顶段平坦，如果不平，必需重新搅拌，然后沉降下来。在加压下，加入过量的洗脱液，用铅笔头或橡皮塞轻轻地从敲打柱子，这将使硅胶颗粒填充得更加紧密。收集从柱子中流出的所有洗脱液，在加入化合物之后重复使用。

【注意：切记不要让溶剂液面低于填充层。】

16）当柱子填充好以后，在硅胶的顶部加入沙子作为保护层。沙层需要填充的比较平整，厚度约在2cm左右。这在添加溶剂时起到保护柱子的作用——当溶剂加入过快时，如果没有沙层的保护，溶剂可能会破坏填充硅胶的平整的表面（因此影响分离效果）。

17）在溶剂还没有达到沙层之前，可以用压缩空气促使溶液层下降。

18）关闭活塞，将第一个试管放在柱子的出口下面。

19）小心地向分离柱中加入你的化合物——当添加液体时，确保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的顶段。当冲洗含有混合物的烧瓶时，小心地一次性地将满满一滴管淋洗液加到分离柱中。然后打开活塞，当液体下降到填充物的顶段时关掉活塞。如此冲洗烧瓶三次。对沉积在硅胶上的混合物，还要再加2cm厚的保护沙层。

20）小心地在分离柱中加满洗脱液。开始时可以用巴斯德球管加入溶剂。当加入了1cm高度的溶剂之后，最好打开活塞。继续用滴管滴加溶剂，直到溶剂高于柱内的填充层几个厘米。现在，可以通过一个粉末漏斗从锥形瓶中加入溶剂了——缓慢地让它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破坏柱内填充物的顶段。

21）当把洗脱液装满分离柱之后，你就可以开始“过柱”了。请记住快的流速将使分离更好地进行。调整空气压力使达到一个快的流速——但不能象消防笼头那么快！保持压力，在收集试管装满后换上一支新的试管。注意随时向柱内补充溶剂。

22) 用TCL跟踪柱子的分离进程。一边收集样品，一边进行薄层色谱分析。这一点可能带来一些忙乱，因此，你若要观察色谱柱工作进展情况，则在一开始便可以减低气压（甚至完全去除）。

23）当操作梯度洗脱时，先用一种溶剂以保证具有较大Rf的化合物先从柱中被洗脱。当他们被安全地洗脱到收集烧瓶之后，便可以更换一种极性更大的溶剂继续洗脱。注意：逐步提高溶剂的极性。过于急速的极性变换可能会使硅胶分裂——就像电影里可怕的地震场面一样，柱内的填充层出现裂缝。这对你的分离将会非常不利！因此，以每100mL（或更多）溶剂中增加5％左右的极性，直至达到所希望的溶剂。然后，用该种洗脱液洗脱，直到目标化合物被洗脱出来。这个时候，你可以继续更换洗脱液或者直接进行下一步。

24）当你确定所有目标化合物都已经从柱内被洗脱的时候，你就可以将每样东西收拾起来了。首先，在分离柱的底端放置一个大烧瓶，然后用一个夹子切断联通分离柱的压缩气体的气路。让气体将剩余的溶剂全部压出柱子，然后干燥硅胶（从分离柱中移出硅胶比较困难，除非它是完全干燥的）。对于大的分离柱，这个过程差不多要耗费一个小时。

25）当分离柱在干燥之时，可开始将组分合并起来。用薄层色谱来确定哪个试管中含有所需的纯样品。将相似纯度的组分合并放在大的圆底烧瓶中，并用旋转蒸发仪进行浓缩。对于费时较长的柱子，可在柱分离过程中就合并流出的组分，以加速进程。

26）当完全除去溶剂后，就可以用NMR分析所得到的化合物了。

本文转自：《麻省理工学院化学系－实验室手册》原文下载：

有机合成丨过柱子（柱层析分离）技巧分享，方法，手段，问题总结

之前在药厂的时候一直觉得拿到一个化合物直接过柱子是一个很low的操作。

因为博主是工厂技术出身，所以拿到化合物的第一个想法就是能不能用结晶，打浆，蒸馏，酸碱洗等方法来纯化 ，如果不能的话还会考虑能不能转化上个保护基啥的，在其他步骤去纯化。

过柱纯粹是个无奈之举。

直到后来进到高校，做起来了毫克级别的反应，才发现是博主狭隘了，上述方法真的不适用，过柱子真的的很香。

而且目前在博主实验室来讲，过柱子的手段太多了，除了人力，还有过柱机，有循环正向制备，有高效液相制备，量少了偷个懒是完全可以的。

当然，像博主这样“特权的”人并不多，“普通人”想要用，是要求他们把传统柱子过好才可以预约的。

我们常说过柱子其实就是柱层析分离，也叫柱色谱， 1903年由俄国科学家首次发明使用，其把植物色素的溶液经过粉碎的碳酸钙粉末，发现从上到下在碳酸钙粉末上有不同的色带，通过对不同色带的分开提取，得到了较纯叶绿素，叶黄素等。

该方法经过经过百年的发展至今已经比较成熟，固定相也从单一的碳酸钙粉末发展到了氧化铝（又分为酸性、中性、碱性），硅胶，活性炭等，其中各大实验室最常用的便是硅胶，一般分为正相硅胶和反相硅胶！

固定相（硅胶）一般要经过纯化和活性处理 ，颗粒大小应当均匀统一，理论上其颗粒越小、同单位质量表面积越大，吸附能力就越高，分离效果也就越好。

但是实际使用中固定相的颗粒太小时往往会存在两个情况，一个是其质更轻，容易飘散在空气中（硅胶进入人体无法降解，越细越毒）；二是颗粒小也会导致颗粒之间缝隙小，从而使溶剂的流速就太慢，耗时；以硅胶为例，目前已经商业化用量最大的硅胶尺寸为200-300目。

过柱手段这块，除了前面说的正向循环制备，高效液相制备，过柱机这些自动分析的设备，手动过柱方面主要分为常压过柱，减压过柱，加压过柱三种 。

其中减压过柱， 因为洗脱剂流速过快，造成吸附效果差，会损失大半部分塔板数，分离效果较差，适合分离TLC板子分的比较开的样品 ，尤其适合产物只有一个大极性杂质的样品；所有其大多数时间被用于化合物的预处理 ，过掉部分杂质后再仔细纯化。要注意的是，使用过程中因为负压带来的溶剂挥发，会导致柱子外表面大量水珠凝结，对水敏感的化合物不要轻易尝试。

常压过柱是三者中分离效果最好的一种过柱方式 ，但是因为很多时候溶剂走的太慢，分离效果再好也会影响效率，所以这时候一般会给与压力，这就是所谓加压过柱；但这个压力不宜过高，一般手动的用双链球，自动的就用个养鱼泵，两者都可以如图改装一下。

……

前面的内容算一些介绍，下面以正相柱层析为例子，讲一下常规的过柱流程：

1，准备工作要做好

选取柱子时，观察有无砂板，没有砂板的柱子记得底部填一些棉花，棉花不宜太厚也不宜太薄，能挡住硅胶不下来就好(博主直接拆一个衣架，用其将棉花塞入旋塞上面的出液口)

配套的准备好最小极性的的洗脱剂，紫外灯（实验室个人推荐手提式，随时可以照一照），加压设备，以及试管架！

2.选取合适的柱子，加入硅胶，浸润硅胶，拍平

柱子的选取非常重要，大小应该根据产物的量来计算，一般可以分为：

实验室最常见柱子直径和高度比值一般在1:2.5到1:15之间，上样时用作固定相的硅胶量是样品量的20～40倍左右 ，选取柱子的标准要实际根据你样品的TLC爬板情况来，如果杂质很多挨得很近，那么尽可能选大一丢丢的柱子，使你的样品正好能铺一小薄层（建议厚度在5mm以下），如果杂质很远，这个厚度自然也可以提高，但也不建议你样品厚度超过2cm，除非这个产物就是简单冲一冲就行。

很多人会犯一个错误，就是想着我硅胶多加点，加的高高的，我样品上厚一点是不是也可以分离的很好？

这个答案是否定的！

理由是这些人从没有想过底下的样品和上面的样品不是在同一起跑线，这样只能的到一部分纯的，大部分是交叉的，过不纯不说，浪费时间浪费溶剂！

这也是为什么样品要求铺薄的原因！

选取柱子后，加入硅胶时可以通过加料漏斗，同时一定要戴上口罩在通风橱里操作，原因博主就不啰嗦了（矽肺）。

至于浸润硅胶，推荐的的流程是 ：先把装好硅胶的硅胶柱竖直放好，硅胶表面用手拍平，硅胶柱底部连接水泵，把硅胶抽实，然后从上面倒入极性最小的洗脱剂，到洗脱剂刚要漏下时，关闭截止阀，防止溶剂抽到水泵。

然后在加压状态，用最小的展开剂冲七八个柱体积就可以把硅胶浸润地均一。

3、上样

上样分为湿法上样和干法上样。

湿法上样， 建议的做法是——用胶头吸管吸取样品，靠近硅胶最上面切面，缓慢均匀滴加样品，直到覆盖一层，然后停止加样，给点压力让油状物沉浸到硅胶层里；油状物沉浸到硅胶层里后重复这种操作多次，直至全部上完样！

有些新同学可能好奇为什么这样操作，而不是一次性把湿法上样的油状物一次性上完呢？

其实这种操作可以减少样品层的有效高度，这时候柱层析已经开始，后面的样品相当于溶剂在推动前面的样品在硅胶里吸附、解吸附。

至于干法上样，除非万不得已博主是不推荐的，固体样品更推荐打浆或者结晶。

干法上样 一般会带来两个方面的问题；一方面拌样的过程中因为要升温旋蒸，增加了样品和硅胶之间反应的可能性；另一方面干法上样就意味着样品层里会引入吸附剂，增加了样品层高度或柱子的尺寸，需要更多的时间，更多的溶剂。

如果不得已选择了，其上样直接把吸附好的粉慢慢倒进柱子就好，一些要求和湿法类似。

4、加入无水硫酸钠或石英砂

为了避免在加洗脱剂时撞击到样品层，使其不均匀，变形，影响分离效率，一般会在样品层上面铺一层无水硫酸钠或者石英砂。

博主个人喜欢铺无水硫酸钠，因为它还有干燥的功能，对于二氯甲烷这种易挥发吸热产生冷凝水的溶剂比较友好！

至于高度多少，就看自己的手法了！

5，梯度洗脱，采样收集

在上样之后，博主个人喜欢先用小极性溶剂（基本不会让产物下去的溶剂）冲柱2-3个柱体积（一个柱体积定义：流动相从流入到流出的体积），确保上下均一，然后选比例洗脱。

至于过柱子的洗脱剂怎么选？

“洗脱剂的比例是你产物TLC爬板爬到Rf值约0.2时的比例。”

这是博主看到很多书中以及很多博主分享的过柱经验，实际过程中也大差不差，个人来讲更喜欢缩小一倍梯度洗脱。

比如如果TLC爬板展开溶剂是PE/EA=2:1，博主更可能从PE/EA=4:1开始梯度洗脱，洗脱到PE/EA=2:1结束，一般效果更好。

还有收集洗脱液的时候也是有技巧的，可以先选大一点的试管接收，TLC快到目标点了就换成小一点的试管，这样可以减少多接一点的可能性，不易包杂。

如果遇到杂质点和产物点挨得比较近的情况，特别是那些荧光又比较弱的，记得不要加压，应选常压过柱，每次接半管或更少就换管，也可以提高纯化几率。

6、柱子切记不要及时处理！

很多新人有个习惯,过柱到了后期，TLC后面一两管没有产物，就默认柱子过完了，压干处理掉。

等到一计算收率才发现收率偏低，或者去打谱发现谱图不正确，抓错点了，后悔莫及。

所以博主建议您过完想要的点后柱子不要急忙处理，打核磁做收率都匹配之后再处理。

如果忙，或者急着用这根柱子纯化其他化合物，建议换大极性良性混合溶剂冲一下，把这部分洗脱液单独留下来等鉴定结果。

……

过柱可能会遇到的一些问题，列如下：

1、洗脱剂和展开剂概念

展开剂是指你TLC爬板时的溶剂比例，洗脱剂是指你过柱时用的溶剂，理论上洗脱剂的极性不应大于展开剂的极性。

但某些特殊不好溶解的产物，过柱后期洗脱剂的极性可能会大些，常用洗脱剂极性以下面顺序递增：

己烷和石油醚<环己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<<甲醇<水<乙酸

至于国外喜欢用的氯仿和乙醚，不建议使用。

2、柱前样的保留

过柱之前一定要留柱前样，特别是比较杂的体系； 同时我也建议你过柱前TLC分析时点浓一点，有些杂质太稀的体系看不到！

3、油状物选择干法上样！？

不建议，不建议，不建议！

博主看到很多硕士研究生这样操作，也看到过一些博士研究生这样操作，当时是懵逼状态，很不理解。

这得要多少的硅胶才能全部吸附住，本来固体只要1~2倍硅胶吸附，你这样操作最起码要十倍以上，也意味着相同柱子，柱效降低10倍以上，甚至远远不止！

如果你告诉我是因为产品固不固，液不液才这样选择，我会告诉你选方法重结晶试试！

4、用了一次的硅胶可以用大极性溶剂（如甲醇）冲柱处理一下再用吗？

不建议再使用，塔板数会降低，柱效差，分离效果也差。

举个最简单易懂的例子，擦完屁屁的卫生纸，再用你都会叠成两层，而且两层的情况下都有可能

“噗”一下弄烂了。

粘一手！

5、硅胶和溶剂会反应吗？

一般和过柱溶剂不反应，但要注意两点:

一个是有些溶剂（如二氯甲烷、石油醚） 和硅胶混合的时候会放热，对温度敏感的化合物要小心；另一个是甲醇会溶解少量硅胶，不太建议用纯甲醇这种太大极性过柱子！

6、洗脱剂选择的问题。

洗脱剂一般要根据展开剂比例选，但有时候PE/EA体系TLC不好时，可以用PE/DCM 体系试一试，说不定有更好的效果！

7、grease峰问题

柱子下面的活塞记得一定不要涂硅脂之类的润滑剂，相似相溶原理，会被淋洗剂带到产品中从而导致杂峰；如果担心漏液，建议采用四氟节门的旋塞。

8、干法上样，样品怎么准备！

吸附时，一定要旋成粉状！

吸附时，一定要旋成粉状！！

吸附时，一定要旋成粉状！！！

重要的事情说三遍。如果没有旋成粉状，成疙瘩颗粒就上样了，运气好可能是过不纯；运气不好可能就如同上图一样产物在柱子前头析出来，如果产品溶解性好也就罢了；如果溶解性特别不好，会导致整个柱子每个地方都有产品，即使用甲醇也一直冲不下来，到时候该怎么办？

分次取出来用大量水洗涤，有机溶剂萃取吗？

实话告诉你，菜籽这么干过！

效果很差，基本上废了！

9、吸附强弱问题

硅胶对化合物的吸附性与化合物结构、官能团息息相关 ，一般含有极性较大的基团的化合物与硅胶吸附也越大，下面是根据个人经验总结的大概排序，可以参考一下：

碱和酸>醇、胺、酰胺、硫醇、酚类>酯、醛、酮>硝基化合物＞芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃

10、如果发现柱子过杂了或选择的极性不对

建议直接换大极性溶剂直接冲下来，重新过柱，以节省时间。

11、柱子有气泡

无论正相柱还是反相柱，柱子内有气泡肯定会影响分离效率的。具体处理方法;

一是用洗脱剂反复压；

另一个就是反复拍，气泡密度影响会往上走。

12、反相柱和正相柱异同

如果过一些极性比较大的化合物如盐酸盐、碱性盐以及含有很多大极性基团的化合物，正相柱就不合适了，此时用到反向柱。

反相硅胶具体就不科普了，但过反相柱有几点需要科普：

①有反向硅胶自然就有反相硅胶板，一般为铝板，两者价格都比较贵，所以要节省使用。

②反向柱体系可以类比HPLC，一般用甲醇-水体系，或乙腈-水体系过柱。过柱极性和正相柱相反，此体系中，甲醇大于水。

③反相柱不适用于全水体系，过完后反相硅胶要用甲醇冲洗干净，不要压干，用甲醇浸没保存

13、酸加酸、碱加碱

两个作用，一个是抑制拖尾；一个是防止分解，特别是碱性化合物如亚胺，由于硅胶是酸性的，一定要小心。

14、选择合适的固定相

我们都知道用硅胶作固定相过柱子的原理其实是吸附与解吸的平衡。

所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，可能导致的后果就是，两个产物点，极性大的却更容易出来。

这种情况在有机合成中是经常遇到的。博主也遇到过多次，此时用氧化铝做固定相可以完美解决！

15、过柱后的产物有些毛毛刺刺的

有些固体过柱后在溶液里TLC时点板是纯的，但是旋干点浓一点就会显现出杂质，相比较再过柱一遍，我更建议你打个浆，溶剂比例选择比洗脱剂极性小一点。

16、酰氯能不能过柱子？

低级的酰氯肯定不适合，一定会分解；但是高级的固体酰氯还是比较稳定的，可以过柱子，但是我还是建议不要轻易接触水，毕竟水滴石穿！

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