有机化合物的分离与纯化方法

有机化合物的分离与纯化方法

分离纯化是有机化合物分析必不可少的过程。有机化合物的样品分析，首先要进行分离纯化步骤，才能达到分析结果准确的目的。不同的有机化合物样品有不同的纯化方法，要根据样品性质与杂质性质的差别来选择分离纯化的方法。

固体有机物的纯化方法

固体有机化合物一般用重结晶法提纯。

1.重结晶原理： 在某一种溶剂中，固体有机化合物的溶解度随温度变化有较大的变化。在较高温度时的饱和溶液趁热过滤除不溶性杂质。母液放冷，在较低温度时有机化合物以晶体析出，过滤，可溶性杂质留在母液中而除去。可反复重结晶直到提纯有机化合物熔点不变为止。

2.一般操作步骤：

（1） 制成饱和热溶液（接近溶剂的沸点）

（2）热过滤（除不溶杂质）

（3） 自然冷却结晶

（4） 过滤晶体与洗涤

（5）干燥（减压或常压）

（6）标准品多次重结晶，直到m.p不变为止

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液体有机物分离提纯方法

液体有机化合物一般用蒸馏法分离提纯

1.蒸馏法原理： 依液体混合物中各组分沸点不同而分离。

2.关键： 控制温度缓慢上升，收集不同温度范围的馏份。

3.蒸馏方法分类：

（1）常压蒸馏适用于b.p较低，在b.p时不分解的物质。

（2）减压蒸馏适用于b.p较高，或在b.p发生分解的物质。

（3）水蒸气蒸馏适用于不与水反应，b.p较高的物质。

（4）旋转浓缩蒸馏法一般用于提取液浓缩。

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柱层析分离（固／液）有机物

1.原理： 混合物被束缚在色谱柱的固定相上，流动相自上而下流经固定相，带动被分离组分向下移动。与固定相作用力大的组分在流动过程中留在了 后面，与固定相作用力小的组分在流动过程中跑在了 前面。

2.柱层析分类：

（1）吸附色谱柱：吸附剂固体表面吸附各成分。

（2）分配色谱柱：惰性载体表面涂高沸点液体，被分离物在淋洗剂与高沸点液体之间溶解分配。

（3）凝胶色谱柱：多凝胶填粒、淋洗，凝胶网眼大小筛分不同尺寸的分子

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薄层色谱分离提纯有机物

薄层色谱分离提纯简单快速。但分离容量不及柱色谱大， 效果也不及柱色谱好。

1.薄层分类：

（1）吸附色谱

（2）分配色谱：分配色谱又分正相色谱与反相色谱。

a.正相：含水吸附剂（固定相），弱极性流动相，极性小的移动快。

b.反相：钝化吸附剂（固定相），强极性流动相， 极性强的移动快。

2.一般操作步骤： 点样—展开—显色—计算Rf 值。

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低温冷冻分离法

1.常用于食品中有机化合物的分析： 有机化合物与大量的脂肪、蜡质混合在一起，给分离造成困难。

2.分离原理： 由于动植物组织中的脂肪、蜡质可以在低温下于丙酮溶液中生成沉淀，将样品用丙酮反复萃取，萃取液经过冷冻，过滤而分离掉脂肪、蜡质沉淀，而有机化合物留在丙酮中。

3.冷冻温度一般在-70℃。

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液相萃取法

1.萃取原理： 一组互不相溶的溶剂中溶有某一成分溶质。这种溶质以一定比例（浓度比）在两相中分配。两相中分配比称分配系数。利用同组溶剂中各物质分配系数不同或同种物质在不同溶剂组中分配系数不同而分开。（选择合适溶剂，反复分配）

2.分类

（1）等容一次分配：一组等容互不相溶的溶剂中加入某一溶质，平衡后弱极性溶剂中有机化合物比值是P；强极性溶剂中比值是Q；显然P+Q=1，两相浓度比为P/Q。

（2）等容多次分配：取几份等体积强极性溶剂在1份弱极性溶剂中萃取几次后，弱极性溶剂中溶质含量是P的n次方,强极性溶剂中溶剂含量是1- P的n次方 。

（3）不等容一次分配：设弱极性溶剂体积是强极性体积的α倍。依定义，一次分配后弱极性溶剂中含量是αP，强极性溶剂中含量为Q；弱极性溶剂中所含有机化合物占有机化合物总量比例为：αP/（Q+αP）。

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化学提纯法

化学提纯法是使杂质与某种试剂发生化学反应除掉或者消除干扰。有机化合物提取液干扰分析成分很大程度是脂肪与色素。最常用的化学净化法是用酸处理对酸稳定的有机化合物或用碱处理对碱稳定的有机化合物来除杂。

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固相萃取技术

1.原理： 根据样品在两相的差异， 即在固相和液相分配系数不同，实现有机物的分离纯化。保留或洗脱的机制取决于被分析物与固相表面活性基团，以及被分析物与液相之间分子作用力。

2.两种洗脱模式：

（1）被分析物与固相之间的亲和力比其与所存在的生物介质的亲和力更强则被保留。用一种亲和力更强的洗脱液洗脱。

（2）存在的生物介质与固相亲和力更强，则用溶剂直接洗脱。

薄层层析技术

薄层色谱，或称薄层层析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行定性与定量分析、分离和鉴定的一种层析分离技术。20世纪50年代从经典柱色谱法及纸色谱法的基础上发展起来的一种平面色谱技术;至20世纪60年代后，人们对薄层色谱法在使用器材的规格、操作方法及术语使用的标准化等方面进行了大量的工作，使该方法日趋成熟和完善，广泛地应用于有机合成中。TLC薄层层析技术作为有机合成中，最直接的监测反应的手段。

原理: 色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。

我们在高中阶段做的叶绿素的提取和分离实验就是薄层层析的一种：纸层析。

特点: 样品分离量少(微克~毫克级)，分析快速。

分类: 按所用固定相材料不同，分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等薄层层析。有机合成中常用的硅胶，氧化铝薄层 属于吸附色谱。

比移值（Rf）： 化合物移动的距离大小用Rf值来表达。这是一个位于0～1之间的数值，它的定义为：化合物最高浓度中心距离原点基线（最先点样时已经确定）的距离除以溶剂的前沿距离原点基线的距离。

点样 ----成功分离的关键

1、点样原点小而圆，直径尽量不要超过2mm（有机溶剂尽量用0.3mm直径毛细管，水等高粘度的溶剂用0.5mm直径的）;

2、在便于显色的前提下，点样量尽量少，防止过载拖尾或掩盖Rf相近的点;

3、点样勿伤及薄层表面;

4、点样原点尽量远离薄层边缘，至少相隔3mm, 减少边缘效应（边缘经常跑歪）;

5、选择规则的矩形薄板;

6、所有点样点要保持在一条与底边平行的直线上，标准点对照时，务必点交叉点；

7、点样完后，溶剂用电吹风尽量吹干。

展开剂的选择： 化合物在薄板上移动距离的多少取决于所选取的溶剂不同。在戊烷和己烷等非极性溶剂中，大多数极性物质不会移动，但是非极性化合物会在薄板上移动一定距离。相反，极性溶剂通常会将非极性的化合物推到溶剂的前段而将极性化合物推离基线。一个好的溶剂体系应该使混合物中所有的化合物都离开基线，但并不使所有化合物都到达溶剂前端，Rf值最好在0.2~0.8之间。虽然这个条件不一定都能满足，但这应该作为薄层色谱分析的目标（在柱色谱中，合适的溶剂应该满足Rf在0.2~0.3之间）。那么，应该选取哪些溶剂呢？一些标准溶剂和他们的相对极性列于如下：【有机溶剂极性表】

常用展开体系极性大小顺序

石油醚<正己烷<二氯甲烷<四氢呋喃<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水

常用的混合体系

EA/PE(hexanes)，DCM/MeOH

PE/DCM，PE/Acetone，Ether/DCM，EA/DCM，Acetone/DCM

展开剂的选择原则

1、对所需成分有良好的溶解性;

2、可使各成分间有较好的分离；

3、待测组分的Rf在0.2~0.8之间；

4、不与待测组分发生化学反应;

5、沸点适中，黏度较小;

6、展开后组分斑点圆且集中;

7、混合溶剂最好新鲜配制。

展开：

1、尽量用新配制展开剂(长时间挥发后比例会改变);

2、展开缸盖子密封性要好;

3、展开剂用量适中，不能漫过点样原点;

4、薄层板侧边不能贴到展开缸壁;

5、薄层板尽量用镊子夹住小心放入展开缸中，而不是用手捏住放入;

6、让溶剂向上展开约90%的薄板长度；

7、理想的展开位置为保证Rf值在0.2~0.8之内。

看板 ----一看、二照、三碘、四显

1、从展开池中取出薄板并且马上用铅笔标注出溶剂到达的前沿位置, 根据这个计算Rf的数值;

2、用镊子小心取出薄层板，吹千溶剂;

3、首先直接观察，画出有色物质的斑点位置;

4、在紫外灯下观察有无暗斑或荧光斑点（并用铅笔画出斑点位置）;

5、大部分有机物会吸附碘，可逆的产生棕色或黄色斑点;

6、千万注意，等高的点，不一定是同一个物质，有可能是极性相同的点，需要用其他监测方法（如LCMS）确定。

7、用破坏性方式观测薄板。当化合物没有紫外活性的时候，只能采用这种方法。在【有机合成中常用TLC显色剂汇总】中，提供了很多非常有用的染色剂。使用染色剂时，将干燥的薄板用镊子夹起并放入染色剂中，确保从基线到溶剂前沿都被浸没。用纸巾擦干薄板的背面。将薄板放在加热板上观察斑点的变化。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，将薄板从加热板上取下。

TLC-MS联用

用小板点成带状，分离少量的样品，刮取a、b、c三个纯点，MS检测出哪个点可能是我们的产物，取得标样，再展开prep-TLC得到纯化后样品，作 NMR鉴定。

TLC监测反应时机: 对于不稳定的化合物各个时机点最好都要监测。

1、反应半小时;

2、反应过夜前后，TLC检测并留样:

3、后处理前后，TLC检测并留样;

4、样品拌硅胶前后，TLC检测并留样;

5、机分样品浓缩冻千前后，TLC检测并留样。

TLC为柱分离寻找条件

1、选择不同的混合体系, 多次尝试，如果想让Rf变得更大一些，可使溶剂体系极性更强些；如果想让Rf变小，就应该使溶剂体系的极性减小些。如果在薄板上点样变成了条纹状而不是一个圆圈状，那么你的样品浓度可能太高了。稀释样品后再进行一次薄板层析，如果还是不能奏效，就应该考虑换一种溶剂体系。

2、找到目标物Rf值0.2左右，并与其他杂质分离度较大的系统;

3、然后根据样品分离度，硅胶规格，柱径比，硅胶与样品比例等综合信

息，选择比Rf值0.2左右体系稍小极性的体系进行柱层析。

（Prep-TLC）制备薄层层析分离样品 ：俗称的爬大板

常见拖尾原因及解决办法

1、首先考虑的是样品浓度过大，薄层板过载导致。这种情况直接降低样品浓度或者是上样量就可以验证了。2、样品对硅胶的吸附能力过强导致的拖尾。对不同体系加入不同的调节剂，酸体系加冰醋酸或甲酸，碱体系加氨水、三乙胺或二乙胺。3、展开剂的极性与样品极性不附，不能做到有效展开导致。可以通过调节展开剂极性解决。4、如果是长带状，那最可能的原因是展开剂对样品的溶解度不够所导致。可以根据极性表换极性相近的对样品溶解度更好的溶剂做展开剂，另外样品未溶解完全，点在班上的样品有未溶固体样品也会导致长条状拖尾。

TLC常用显色剂汇总

4-甲氧基苯甲醛显色 (广谱显色剂)

原料 ： 1. 4-甲氧基苯甲醛 (p-anisaldehyde) 13mL 2. 醋酸 (AcOH) 5mL3. 浓硫酸 (conc. H2SO4) 18mL4. 乙醇 (EtOH) 478mL

调配方法： 把1,2,4在冰浴条件下混合后，缓慢滴加3，冷藏保存。

磷钼酸显色剂 (广谱显色剂，特别是含有羟基的化合物)

原料： 1. 磷钼酸 (12MoO3.H3PO4) 5g 2. 乙醇 (EtOH) 100mL

调配方法： 把1,2混合成溶液

注意：需要热风枪烘烤才能显色

铈 – 钼酸铵显色 别名：HANESSIAN染色液(广谱显色剂)

原料： 1. 钼酸铵 ((NH4)6Mo7O24・4H2O) 25g 2. 硫酸铈 (Ce(SO4)2) 5g3. 浓硫酸 (conc. H2SO4) 50mL4. 蒸馏水 (H2O) 450mL调配方法： 把1,2,3,4混合后即可使用

硝酸铈铵 (适用于：大分子醇类)

原料：

1．1%硝酸铈铵的0.2mol/L硝酸溶液；

2. N,N-二甲基-对苯二胺盐酸盐1.5g溶于甲醇(128ml)、水(25ml)与乙酸(1.5ml)混合液

调配方法：将(1)与(2)等量混合。

喷板后于105℃加热5min。

茚三酮显色 (适用于：胺基化合物)

原料： 1. 茚三酮 ((ninhydrin) 0.3g 2. 醋酸 (AcOH) 3mL 3. 正丁醇 (n-BuOH) 100mL 调配方法：把1,2,3混合成溶液即可。

小窍门：对于比较难显色的胺基化合物， 把TLC蘸一下HBr溶液加热烤一下后再蘸取茚三酮显色剂

二硝基苯肼显色 简称：DNP显色 (适用于：醛或酮类)

原料： 1. 2,4-二硝基苯肼 12g 2. 浓硫酸 (conc. H2SO4) 60mL3. 蒸馏水 (H2O) 80mL4. 乙醇 (EtOH) 200mL调配方法： 把1,2,3,4混合成溶液即可。

碱性高锰酸钾显色 (广谱显色剂，特别是还原性化合物)

原料： 1. 高锰酸钾(KMnO4) 1.5g 2. 碳酸钾 (K2CO3) 10g 3. 氢氧化钠 (NaOH) 0.125g 4. 蒸馏水 (H2O) 200mL调配方法： 把1,2,3,4混合成溶液即可。

注意要点： 试剂寿命比较短，一般三个月以内就得重新配置。

硝酸银/过氧化氢 (适用于：卤代烃类)

原料：

1. 硝酸银0.1g溶于水1ml

2. 2-苯氧基乙醇l00ml溶于丙酮200mL

3. 30%过氧化氢1滴

调配方法： 把1,2,3混合成溶液即可。

方法：喷后置紫外光下照射；

现象：斑点呈暗黑色。

氯化铁 （适用于：酚类、羟酰胺酸）

原料：1%～5%氯化铁的0.5mol/L盐酸溶液。

现象：酚类呈蓝色、羟酰胺酸呈红色。

溴甲酚绿显色 简称：BCG显色 (适用于：羧酸类等含有酸性基团的化合物)

原料： 1. 溴甲酚绿(Bromocresol green) 40mg 2. 乙醇 (EtOH) 100mL3. 0.1N 氢氧化钠水溶液 适量

调配方法：把1,2混合后，往里面滴加3直到溶液变成蓝色。

过氧化氢 （适用于：芳香酸）

原料：0.3%过氧化氢溶液。

使用方法：喷后置紫外光(365nm)下观察。

现象：呈强蓝色荧光。

DRAGENDORFF试剂显色 (适用于：含氮化合物)

原料： 1. 次硝酸铋 (Bismuth subnitrate) 1.7g 2. 醋酸 (AcOH) 20mL 3. 蒸馏水 (H2O) 80mL 4. 碘化钾 (KI) 40g5. 蒸馏水 (H2O) 100mL调配方法：A液: 1+2+3， B液：4+5， A液(5mL)+B液(5mL)+醋酸(20mL)+蒸馏水(70mL) 混合配成

香草醛显色 (广谱显色剂)

原料： 1. 香草醛((Vanillin) 15g 2. 浓硫酸 (conc. H2SO4) 2.5mL3. 乙醇 (EtOH) 250mL调配方法：把1,2,3混合后配成，使用寿命较短。

碘/硅胶显色 (广谱显色剂)

原料： 1. 碘(I2) 适量 2. 硅胶(SiO2) 适量 调配方法： 把1,2混合在密闭容器中静置，显色的时候直接只需要把TLC放进去即可，碘熏后，用水冲一下，可以增强显色效果，并可以固定住显色一段时间。

紫外灯-UV LAMP (适用于：共轭结构化合物)

具有芳香环的化合物，或者其他共轭结构的化合物

5%的硫酸乙醇（广谱显色剂，尤其是含有羟基等易于氧化的基团）

原料：

1. 98%的浓硫酸 1 g

2. 乙醇 19 g

调配方法：将浓硫酸缓慢加入到乙醇中，加入少量无水硫酸镁干燥。

水 (适用于：最后的手段！)

在所有的显色剂都没用的情况下，把TLC稍微浸点水后，对着光看，有可能看到化合物的点(有机化合物不溶于水)

茜素 (适用于：硼酸/硼酸酯类化合物)

配制：1 M 的茜素丙酮溶液

显色的时候直接只需要把TLC放进去，在366nm紫外灯下观察有亮黄色荧光点。

茜素——一种高效的硼酸TLC显色剂

注：TLC板在浸润显色剂后，不一定能立刻显色的，有的需要热烤才能显色！

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